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1 范围
本标准规定了液相色谱法快速检测原料乳中三聚氰胺的方法。
本标准适用于原料乳，也适用于不含添加物的液态乳制品。
本标准定量检测范围为0.30 mg/kg~100.0 mg/kg，方法检测限为0.05 mg/kg。 注：当原料乳中三聚氰胺的含量大于100.0 mg/kg时，具体操作方法见6.2.2.3.2。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的
修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准
GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第1部分：总则与定义 GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第2部分：确定标准测量方法重复性与
再现性的基本方法 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
3 原理
用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂，强阳离子交换色谱柱分离，高效液相色谱
-紫外检测器/二极管阵列检测器检测，外标法定量。
4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.2 磷酸（H3PO4）。 4.3 磷酸二氢钾（KH2PO4）。 4.4 三聚氰胺标准物质（C3H6N6）：纯度大于或等于99%。 4.5 三聚氰胺标准贮备溶液：1.00×103 mg/L。
称取100 mg 三聚氰胺标准物质（准确至0.1 mg），用水完全溶解后，100 mL 容量瓶中定容至刻度，
混匀，4℃条件下避光保存，有效期为1 个月。
4.6 标准工作溶液：使用时配制。
4.6.1 标准溶液A：2.00 ×102 mg/L。
准确移取20.0 mL 三聚氰胺标准贮备溶液（4.5），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
4.6.2 标准溶液B：0.50 mg/L。
准确移取0.25 mL 标准溶液A（4.6.1），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
4.6.3 按表1 分别移取不同体积的标准溶液A（4.6.1）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。按表2
分别移取不同体积的标准溶液B（4.6.2）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
表1 标准工作溶液配制（高浓度）
| 标准溶液A体积（mL） |
0.10 |
0.25 |
1.00 |
1.25 |
5.00 |
12.5 |
| 定容体积（mL） |
100 |
100 |
100 |
50.0 |
50.0 |
50.0 |
| 标准工作溶液浓度（mg/L） |
0.20 |
0.50 |
2.00 |
5.00 |
20.0 |
50.0 |
表2 标准工作溶液配制（低浓度）
| 标准溶液A体积（mL） |
1.00 |
2.00 |
4.00 |
20.0 |
40.0 |
| 定容体积（mL） |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
| 标准工作溶液浓度（mg/L） |
0.005 |
0.01 |
0.02 |
0.10 |
0.20 |
4.7 磷酸盐缓冲液：0.05 mol/L。
称取6.8 g磷酸二氢钾（4.3）（ 准确至0.01 g），加水800 mL完全溶解后，用磷酸（4.2）调节pH至3.0，
用水稀释至1 L，用滤膜（4.9）过滤后备用。
4.8 一次性注射器：2 mL。
4.9 滤膜：水相，0.45 μm。
4.10 针式过滤器：有机相，0.45 μm。
4.11 具塞刻度试管：50 mL。
5 仪器
5.1 液相色谱仪：配有紫外检测器/二极管阵列检测器。
5.2 分析天平：感量0.0001 g 和0.01 g。
5.3 pH 计：测量精度±0.02。
5.4 溶剂过滤器。
6 测定步骤
6.1 试样的制备
称取混合均匀的15 g原料乳样品（准确至0.01 g），置于50 mL具塞刻度试管（4.11）中，加入30 mL
乙腈（4.1），剧烈振荡6 min，加水定容至满刻度，充分混匀后静置3 min，用一次性注射器（4.8）吸
取上清液用针式过滤器（4.10）过滤后，作为高效液相色谱分析用试样。
6.2 高效液相色谱测定
6.2.1 色谱条件
a) 色谱柱：强阳离子交换色谱柱，SCX，250 mm × 4.6 mm（i.d.），5 μm，或性能相当者。
注： 宜在色谱柱前加保护柱（或预柱），以延长色谱柱使用寿命。
b) 流动相：磷酸盐缓冲溶液（4.7）- 乙腈（70+30，体积比），混匀。
c) 流速：1.5 mL/min。
d) 柱温：室温。
e) 检测波长：240 nm。
f) 进样量：20 μL。
6.2.2 液相色谱分析测定
6.2.2.1 仪器的准备
开机，用流动相平衡色谱柱，待记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线。基线稳定后开始进样。
6.2.2.2 定性分析
依据保留时间一致性进行定性识别的方法。根据三聚氰胺标准物质的保留时间，确定样品中三聚氰
胺的色谱峰（参见附录A）。必要时应采用其他方法进一步定性确证。
6.2.2.3 定量分析
校准方法为外标法。
6.2.2.3.1 校准曲线制作
根据检测需要，使用标准工作溶液（4.6.3）分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为
纵坐标，绘制校准曲线。
6.2.2.3.2 试样测定
使用试样（6.1）分别进样，获得目标峰面积。根据校准曲线计算被测试样中三聚氰胺的含量（mg/kg ）。
试样中待测三聚氰胺的响应值均应在方法线性范围内。
注：当试样中三聚氰胺的响应值超出方法的线性范围的上限时，可减少称样量再进行提取与测定。
6.2.3 结果计算
6.2.3.1 计算公式
结果按式（1）计算：
X = c ×(V/m)×(1000/1000) ……………………………（1）
式中：
X——原料乳中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c ——从校准曲线得到的三聚氰胺溶液的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；
m——样品称量质量，单位为克（g）。
6.2.3.2 计算结果有效数字
通常情况下计算结果保留3位有效数字；结果在0.1~1.0 mg/kg 时，保留2位有效数字；结果小于0.1
mg/kg 时，保留1位有效数字。
6.3 平行试验
按以上步骤，对同一样品进行平行试验测定。
6.4 空白试验
除不称取样品外，均按上述步骤同时完成空白试验。
6.5 方法检测限
本方法的检测限为0.05mg/kg 。
6.6 回收率
在添加浓度0.30 mg/kg~100.0mg/kg 范围内，回收率在93.0%~103% 之间，相对标准偏差小于10% 。
7 精密度
本标准精密度数据按照GB/T6379.1 和GB/T6379.2 规定确定，其重复性和再现性值以95%的置信度
计算。
7.1 重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测量结果的绝对差值不超过重复性限r，样品中三聚氰胺含量范
围及重复性方程见表3。
如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。
7.2 再现性
在再现性的条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，样品中三聚氰胺的含
量范围及再现性方程见表3。
表3 三聚氰胺含量范围及重复性和再现性方程
| 成分 |
含量范围（mg/kg） |
重复性限（r） |
再现性限（R） |
| 三聚氰胺 |
0.3~100.0 |
lgr= -1.260+ 0.9286 lgm |
lgR= -0.7044 + 0.7744 lgm |
注：m 表示两次测定结果的算术平均值，单位为mg/kg 。
7.3 重复性与再现性参考值
表4列出了m在不同范围时的r与R值，供参考。
| m（mg/kg） |
0.30~0.40 |
0.40~0.50 |
0.50~1.00 |
1.00~2.00 |
2.00~2.50 |
2.50~10.0 |
| r |
0.02 |
0.02 |
0.03 |
0.05 |
0.10 |
0.13 |
| R |
0.08 |
0.10 |
0.12 |
0.20 |
0.34 |
0.40 |
| m（mg/kg） |
10.0~20.0 |
20.0~40.0 |
40.0~60.0 |
60.0~80.0 |
80.0~100.0 |
80.0~100.0 |
| r |
0.47 |
0.89 |
1.69 |
2.46 |
3.22 |
3.22 |
| R |
1.17 |
2.01 |
3.44 |
4.71 |
5.88 |
5.88 |
8 试验报告
试验报告应包括以下内容：
a) 鉴别样品、实验室和分析日期等资料；
b) 遵守本标准规定的程度；
c) 分析结果及其表示；
d) 测定中观察到的异常现象；
e) 对分析结果可能有影响而本部分未包括的操作或者任选的操作。
9 质量保证 a) 操作人员应按照国家相关规定，并具备从事相应实验技术的能力； b) 仪器及相关计量器具应通过检定或校准，并在有效使用期内； c) 宜采用有证标准物质，若采用自配标样，应使用有证标准物质对自配标样进行验证； d) 原料乳样采集和保存应严格执行本标准和国家相关规定，实施全过程质量保证。
10 注意事项 a) 如果保留时间或柱压发生明显的变化，应检测离子交换色谱柱的柱效以保证检测结果的可靠性； b) 使用不同的离子交换色谱柱，其保留时间有较大的差异，应对色谱条件进行优化； c) 强阳离子交换色谱的流动相为酸性体系，每天结束实验时应以中性流动相冲洗仪器系统进行维
护保养。
附录A
（资料性附录）
三聚氰胺参考色谱图
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